最近，很多同学向小尚反映细胞复苏经常遇到困难。细胞复苏是细胞培养中的一项常规操作，但其中的许多细节常常被忽视。复苏的成败与冻存及复苏操作密切相关，一不小心就可能酿成大错。本文将从冻存的角度进行分析，下周将更新复苏操作的原因排查，欢迎各位同学收藏关注!

首先，让我们回顾一下冻存步骤：

1. 提前准备好冻存液。
2. 离心获得细胞沉淀后，加入冻存液轻轻重悬细胞。
3. 将细胞悬液转移至冻存管中。
4. 如果使用程序冻存液，将冻存管放入程序冻存盒中，置于-80℃冰箱过夜后存入液氮。如果使用非程序冻存液，则无需冻存盒。

常见冻存错误操作

1. **未使用适当的冻存盒**：当使用常规含血清的冻存液（培养基+血清+DMSO）时，如果没有使用程序降温冻存盒或泡沫盒等保温措施，降温过快可能导致细胞因冰晶的形成而破裂死亡。建议使用商用程序冻存盒，确保温度以1℃/min的速度缓慢下降。没有冻存盒的同学可以将冻存管放在泡沫盒中在4℃静置5-10分钟，再转入-20℃静置2小时后，最后移入-80℃冰箱过夜，第二天再转入液氮保存。如果没有冻存盒和泡沫盒，建议使用无血清的非程序冻存液，因其含有更多保护剂，可以直接重悬细胞后置于-80℃冰箱过夜，再转入液氮。

2. **冻存前细胞状态不佳或冻存密度过低**：良好的细胞状态是复苏成功的前提。冻存时应选择对数生长期且汇合度达到80%以上的细胞。若冻存前细胞培养上清呈橘黄色，建议更换培养基后静置培养4小时再进行冻存。冻存密度应保持在200-300万/mL/管，若不方便计数，可以按一个T25培养瓶冻存1-2管，一个10cm培养皿冻存2-3管（确保细胞汇合度在80%以上）。

3. **直接将DMSO加入细胞悬液**：DMSO在稀释时会放热，可能对较脆弱的细胞造成损伤。因此，建议提前配制冻存液后再处理细胞，以确保细胞的存活率。

4. **未经过适当降温直接放入液氮**：冻存液重悬细胞后要经过-80℃冰箱降温，直接放入液氮中会导致细胞死亡。绝对不要将细胞放在液氮罐口降温。

5. **冻存液配方不合适**：研究表明，5%-10%的DMSO适合大多数细胞冻存，具体比例应根据细胞种类进行调整。对于对DMSO敏感的细胞，需要降低其比例。根据小尚的经验，8%的DMSO适用于大部分细胞系。同时，还需根据细胞培养难度调整血清比例，难养的细胞需要添加更多血清。对于过于脆弱的细胞，推荐使用血清+DMSO进行冻存，而不添加培养基。在冻存前，建议进行一次冻检，以确认细胞状态良好后再进行大规模冻存。确保在冻检成功前至少保留一瓶细胞培养，以免因复苏失败导致细胞绝种。

6. **冻存条件不当或冻存时间过长**：液氮储存的稳定性优于-80℃冰箱，后者因频繁开关导致温度不够稳定，细胞活率下降较快，因此建议尽量将细胞存放于液氮中。如果没有液氮罐，同学们可以将冻存管放在-80℃冰箱的内部位置，并定期进行复苏检测活性。

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