尊龙凯时为您提供的RFL-6大鼠成纤维细胞培养指南，包括细胞的培养条件、处理步骤和注意事项，确保您在实验室中的细胞培养工作顺利进行。

一、细胞培养条件

细胞名称：RFL-6大鼠成纤维细胞
生长特性：贴壁生长
冻存条件：无血清冻存液（货号：C7001）
培养体系：DMEM+10%FBS+1%双抗
传代方法：首次建议以1:2比例传代，传代情况每两天更换培养基。
备注：使用无菌离心管收集培养基以作对比培养，若效果不佳，建议直接购买尊龙凯时的完全培养基。

二、细胞收到后的处理

将细胞培养至良好状态后，灌满完全培养液并严密封口是确保细胞运输效果的最佳方法。收到细胞后，首先用75%酒精喷洒整个细胞瓶进行消毒，随后在超净工作台内进行无菌操作，并将细胞瓶放入37℃、5% CO₂ 的培养箱中稳定3-4小时以促进细胞适应。使用显微镜观察细胞的生长状况，并拍摄不同倍数的照片（最好有40x、100x、200x各一张），前三天的照片为售后服务的重要依据，未提供照片默认为状态良好。

三、细胞培养步骤

a. 细胞传代

如果未超过80%汇合度，将瓶装的完全培养液收集至离心管中，保留5ml完全培养基在37℃、5% CO₂孵箱中培养；如果细胞密度超过80%，可进行传代。具体步骤如下：

1. 弃去培养上清，使用不含钙、镁离子的PBS清洗细胞1-2次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml，置于37℃培养箱消化1-2分钟，显微镜下观察细胞状态，若细胞大部分变圆并脱落，迅速加入5ml以上完全培养基终止消化。
3. 轻轻吹打细胞使其完全脱落后吸出，将悬液转移至15ml离心管中，在1000RPM下离心5分钟，弃去上清，补加1-2ml完全培养基重悬。
4. 将细胞按1:2的比例分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，放入37℃、5% CO₂的细胞培养箱中培养。

b. 细胞冻存

1. 当细胞生长至覆盖培养瓶80%面积时，弃去T25培养瓶中的培养液，使用PBS清洗一次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml，观察细胞回缩变圆，加入5ml完全培养液终止消化，轻轻吹打细胞使其脱落，转移至15ml离心管中，在1000rpm离心5分钟。
3. 弃去上清，沉淀细胞，加入1ml的无血清冻存液（货号：C7001），混匀后装入冻存管。
4. 将冻存细胞放入-80℃冰箱，若后期需转入液氮罐中，需在-80℃冰箱存放超过24小时再转入液氮罐。

c. 细胞复苏

1. 从液氮中取出细胞冻存管（注意佩戴防护面具），迅速置入37℃水浴中解冻，确保冻存管中没有结晶后，用75%酒精擦拭外壁。
2. 将冻存管中的细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000rpm离心5分钟。
3. 弃去上清，用5ml完全培养基重悬，接种至T25培养瓶，放入37℃、5% CO₂ 的细胞培养箱中。
4. 第二天更换为新鲜的完全培养基继续培养。

四、注意事项

在运输过程中，由于某些细胞贴壁不牢，有可能导致细胞脱落，这是正常现象。若脱落较多，可将瓶中液体收集至离心管中，1000rpm离心5分钟，收集上清进行过渡培养（后期进行对比培养）。沉淀后加入胰酶1-2ml，轻轻吹打重悬，消化1-2分钟后加5ml完全培养基终止反应，再离心，弃上清，补加1-2ml完全培养基后，按1:2比例进行分瓶传代（两个T25），补充新的完全培养基至5-8ml，并放入37℃、5% CO₂的细胞培养箱中进行培养。

五、售后条款

尊龙凯时为客户提供专业的售后支持，以下是细胞出现问题时的重发政策：

1. 如细胞在运输途中存在问题，如丢失、瓶身破损、培养液严重漏液等，支持重发。
2. 收到产品后48小时内如遇到细胞污染，请提供真实实验结果，核实后重发。
3. 常温发货的细胞静置24小时或干冰冻存发货的细胞复苏后24小时未存活（需提供真实的细胞状态照片），可重发。
4. 如出现污染，干冰发货的细胞复苏后24小时内或常温发货的细胞静置4小时后未开封，支持重发。
5. 细胞活性问题，需在收到产品7天内提供真实实验结果，使用台盼蓝染色法鉴定活性，核实后重发。
6. 客户需在收到当天或第2、3天提供照片，未及时告知的视为产品合格。若4-7天内有问题需提供前3天照片及相关操作详细步骤，与技术人员沟通后判断责任方的，技术人员将予重发。

对于不予重发的情况包括：因客户造成的细胞污染、操作不当、非推荐培养体系导致的细胞状态不佳等。具体情况由双方协商处理。在使用尊龙凯时的细胞时，请务必遵循相关操作规范，以确保实验的成功。