尊龙凯时为您带来一份详细的实验准备与操作步骤,旨在提高生物医学研究中的细胞分离技术的有效性和可靠性。
实验前准备
试剂准备
首先,配制40% Percoll溶液:将Percoll细胞分离液与PBS缓冲液(10×)按照体积比例9:1混合,获得等渗的100% Percoll母液。接着,将100% Percoll母液与RPMI1640/1×PBS以4:6的比例混合,生成40%等渗Percoll溶液。
对于80% Percoll溶液,同样地,将Percoll细胞分离液和PBS(10×)以9:1的比例组合,制备100%等渗Percoll母液。随后,将其与RPMI1640/1×PBS按照8:2的比例混合,以制备80%等渗Percoll溶液。
肠道固有层免疫细胞分离步骤
1)使用颈椎脱臼法处死小鼠,将其固定于手术台上,之后用75%酒精消毒小鼠腹部,并在正中纵切腹部以暴露腹腔;
2)在小鼠胃与十二指肠的连接处剪断,一边分离小肠周围的脂肪组织与肠系膜,一边小心地提取小肠。最后,在小肠与盲肠连接处剪断,成功分离出小肠。
3)在10cm培养皿中加入5mL预冷的4°C PBS,将步骤2中分离的小肠放入培养皿,使用镊子和剪刀逐步去除脂肪组织和派伊尔结。派伊尔结是小鼠肠道黏膜免疫系统的重要组成部分,去除派伊尔结能够确保获取更纯净、更具代表性的细胞群体,提高实验结果的准确性。
4)将小肠切成四段,采用剪刀纵向剪开,轻轻刮除肠内容物;
5)将小肠转移至含有10mL HBSS+2% FBS的50mL离心管中,剧烈涡旋10-20秒;
6)使用镊子取出小肠,并重复清洗两次;
7)将清洗后的肠组织剪碎成0.5cm的小片,并将100-200mg的组织块转移至2mL圆底管中,加入1mL小鼠肠道组织解离液,在37°C的水平摇床上轻轻摇晃孵育60分钟(时间可根据组织状况适当调整);
8)从摇床中取出圆底管,剧烈涡旋10-20秒,并通过70μm细胞筛网过滤,使用10mL PBS冲洗细胞筛网;
9)将含有细胞的滤液收集至50mL管中,在20°C下以400g离心5分钟,弃去上清液,用4mL的40% Percoll重悬细胞沉淀,并转移至15mL离心管;
10)注入25mL的80% Percoll至15mL离心管底部,试管略微倾斜,缓慢添加4mL的40% Percoll与细胞混合液,形成密度梯度。注意:切勿破坏两者间的分界面,确保新鲜制备;
11)在800g、20°C下离心20分钟;
12)离心后,吸取中间的白膜层免疫细胞至新15mL离心管中,加入3倍体积的4°C预冷PBS,颠倒混合,400g离心5分钟,弃去上清;
13)按照步骤12重复清洗一次,弃去上清以获得肠道固有层淋巴细胞;
14)将细胞染色缓冲液重悬细胞沉淀,调整细胞浓度至5-10×106 cells/mL,并将100μL/管的细胞悬液分配至12×75mm流式管中,准备进行后续实验操作。
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