尊龙凯时为您带来一份详细的实验准备与操作步骤，旨在提高生物医学研究中的细胞分离技术的有效性和可靠性。

实验前准备

试剂准备

首先，配制40% Percoll溶液：将Percoll细胞分离液与PBS缓冲液（10×）按照体积比例9:1混合，获得等渗的100% Percoll母液。接着，将100% Percoll母液与RPMI1640/1×PBS以4:6的比例混合，生成40%等渗Percoll溶液。

对于80% Percoll溶液，同样地，将Percoll细胞分离液和PBS（10×）以9:1的比例组合，制备100%等渗Percoll母液。随后，将其与RPMI1640/1×PBS按照8:2的比例混合，以制备80%等渗Percoll溶液。

肠道固有层免疫细胞分离步骤

1）使用颈椎脱臼法处死小鼠，将其固定于手术台上，之后用75%酒精消毒小鼠腹部，并在正中纵切腹部以暴露腹腔；
2）在小鼠胃与十二指肠的连接处剪断，一边分离小肠周围的脂肪组织与肠系膜，一边小心地提取小肠。最后，在小肠与盲肠连接处剪断，成功分离出小肠。

3）在10cm培养皿中加入5mL预冷的4°C PBS，将步骤2中分离的小肠放入培养皿，使用镊子和剪刀逐步去除脂肪组织和派伊尔结。派伊尔结是小鼠肠道黏膜免疫系统的重要组成部分，去除派伊尔结能够确保获取更纯净、更具代表性的细胞群体，提高实验结果的准确性。

4）将小肠切成四段，采用剪刀纵向剪开，轻轻刮除肠内容物；
5）将小肠转移至含有10mL HBSS+2% FBS的50mL离心管中，剧烈涡旋10-20秒；
6）使用镊子取出小肠，并重复清洗两次；
7）将清洗后的肠组织剪碎成0.5cm的小片，并将100-200mg的组织块转移至2mL圆底管中，加入1mL小鼠肠道组织解离液，在37°C的水平摇床上轻轻摇晃孵育60分钟（时间可根据组织状况适当调整）；

8）从摇床中取出圆底管，剧烈涡旋10-20秒，并通过70μm细胞筛网过滤，使用10mL PBS冲洗细胞筛网；
9）将含有细胞的滤液收集至50mL管中，在20°C下以400g离心5分钟，弃去上清液，用4mL的40% Percoll重悬细胞沉淀，并转移至15mL离心管；

10）注入25mL的80% Percoll至15mL离心管底部，试管略微倾斜，缓慢添加4mL的40% Percoll与细胞混合液，形成密度梯度。注意：切勿破坏两者间的分界面，确保新鲜制备；

11）在800g、20°C下离心20分钟；
12）离心后，吸取中间的白膜层免疫细胞至新15mL离心管中，加入3倍体积的4°C预冷PBS，颠倒混合，400g离心5分钟，弃去上清；

13）按照步骤12重复清洗一次，弃去上清以获得肠道固有层淋巴细胞；
14）将细胞染色缓冲液重悬细胞沉淀，调整细胞浓度至5-10×10⁶ cells/mL，并将100μL/管的细胞悬液分配至12×75mm流式管中，准备进行后续实验操作。

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