血管生成(angiogenesis)是指新血管从已有血管中形成的生物学过程。当血管生成的刺激因子与内皮细胞上的受体结合时,会引发一系列血管生成程序。这些程序包括基底膜的破坏、内皮细胞的迁移、侵袭、增殖以及向毛细血管的分化。血管生成是一个至关重要的生物过程,不仅在癌症的发展和非肿瘤性疾病中发挥着重要作用,也参与生物体的正常生理功能,如生殖、发育以及组织修复等功能。同时,血管生成是一个复杂的过程,受到生长因子、趋化因子和血管生成素等内源性促血管生成因子的动态调节,同时也受到内皮抑制剂如血小板反应蛋白-1的影响,这涉及细胞与细胞之间、细胞与基质之间的相互作用。
在启动血管生成的过程中,内皮细胞通过碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)和表皮生长因子(EGF)等信号的激活而释放蛋白酶以降解基底膜。继而,内皮细胞会快速增殖迁移,形成新芽,将以每天几毫米的速度构建出新的血管网络。
目前,血管生成的检测方法主要包括体内和体外两种方式。体外方法通常用于监测血管生成过程中的特定阶段,在早期评估中具有重要的应用价值,而体内方法则能够更准确地模拟生命体微环境,提供更多相关信息。常用的体外实验包括增殖能力检测、迁移能力检测和管形成实验,体内实验则涵盖了雏鸡绒毛尿囊膜(CAM)测定、角膜血管生成实验和基质胶内血管生成实验等。为了获得全面且准确的数据,往往需要结合多种检测方法。本篇文章将专注于血管生成检测方法中应用最广泛的成管实验。
管形成实验
管形成实验(Tube Formation Assay)是一种快速定量方法,旨在模拟血管生成过程,以确定参与血管生成的基因或途径。该实验利用了体外培养的内皮细胞保留响应血管生成信号的能力,能够快速分裂和迁移。该实验最早于20世纪80年代建立,早期实验数据显示,在没有基底膜提取物的情况下,内皮细胞需要长达4-6周的时间才能形成管状网络。之后,Kubota将内皮细胞接种到重组基底膜的基质中,结果显示内皮细胞能够迅速形成类似于体内环境的毛细血管样结构,这一发现为管形成实验提供了一种高效的表型检测方式。
目前的实验常见方式是将内皮细胞在含有细胞外基质成分(如层粘连蛋白、巢蛋白、胶原蛋白等)和生长因子(如VEGF、EGF等)的基质胶上培养。在预定时间点拍摄图片,通过软件分析得到定量数据,从而观察三维毛细血管样结构的形成能力。这种方法简单、可靠且功能强大,广泛应用于研究血管生成的抑制剂和激活剂,探索血管生成机制,或定义内皮细胞群等。
实验步骤
以人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为例,以下是常见的管形成实验流程:
1. 实验准备
(1)准备实验材料:在4°C条件下低温融化基质胶,并预冷所需器材(如枪头、细胞培养板等)。铺设基质胶时,需在冰盒上进行以避免其在温暖环境中凝固。
(2)基质胶的稀释与铺板:使用DMEM或条件培养基将基质胶稀释至8-12mg/mL,需根据实际情况调整。因每批基质胶浓度可能有所不同,建议在使用前进行不同梯度的稀释。将50μL稀释后的基质胶加入孔板,避免产生气泡,并在37℃培养箱中放置30-45分钟。
(3)细胞预处理:对于状态良好的细胞,使用标准的传代程序预处理。对HUVEC细胞进行饥饿处理,将完全培养基更换为含1% FBS的DMEM培养基,培养24小时。
2. 细胞铺板
(1)用杜氏磷酸缓冲液(DPBS)清洗细胞,加入胰蛋白酶消化HUVEC,离心沉淀后,用含10% FBS的DMEM或条件培养基重悬细胞,进行多次细胞计数以确保准确性。
(2)每孔加入100μL细胞悬液,接种密度为1至3×104个细胞/孔,注意保持枪头垂直,避免接触孔内的凝胶。
3. 细胞培养观察
(1)在37℃、5% CO2条件下培养细胞。
(2)可根据时间梯度进行观察,使用光学显微镜检查细胞。一般情况下,细胞在2-4小时内开始形成管状结构。HUVEC细胞在基质胶中约4小时后初步成管,管形成峰值一般在2-12小时之间,随后会出现结构塌缩现象。
(3)拍摄毛细管网络的图像,并使用相关软件分析管状网络的各类数据。
实例结果解读
HUVECs在实验过程中的行为变化表明,细胞在1小时左右附着于基质膜,随后在2-4小时内相互迁移形成毛细管样管,6-16小时后形成成熟的管状结构。24小时后,细胞逐渐凋亡,小管结构破裂并与基质分离。
常见问题
1. **阳性诱导剂对照组中无管网络形成如何处理?** 可能原因包括细胞老化、损伤、细胞状态不佳及基质胶浓度不适等。应采用健康且代数较低的细胞,并调整细胞接种密度。此外,确保使用的新鲜、质量良好的基质胶。
2. **怎样操作可使基质胶铺板均匀?** 确保基质胶低温保存并在冰上操作,垂直加入胶液,并确保固化时平面水平。
3. **成管实验需要多长时间?** 实验时长与细胞状态以及培养基血管生成因子的浓度有关,通常状态良好的细胞在2-3小时内开始成管。
4. **内皮细胞聚团如何处理?** 应检查细胞状态、调整接种密度及确保基质胶质量良好。
5. **应包含哪些对照组?** 初次实验需设置空白对照、阳性对照和阴性对照,并观察不同浓度的药物效果。
6. **应选择手动还是自动监测?** 选择性能取决于实验需求,若需处理大量样本,建议使用自动监测。
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