血管生成（angiogenesis）是指新血管从已有血管中形成的生物学过程。当血管生成的刺激因子与内皮细胞上的受体结合时，会引发一系列血管生成程序。这些程序包括基底膜的破坏、内皮细胞的迁移、侵袭、增殖以及向毛细血管的分化。血管生成是一个至关重要的生物过程，不仅在癌症的发展和非肿瘤性疾病中发挥着重要作用，也参与生物体的正常生理功能，如生殖、发育以及组织修复等功能。同时，血管生成是一个复杂的过程，受到生长因子、趋化因子和血管生成素等内源性促血管生成因子的动态调节，同时也受到内皮抑制剂如血小板反应蛋白-1的影响，这涉及细胞与细胞之间、细胞与基质之间的相互作用。

在启动血管生成的过程中，内皮细胞通过碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）和表皮生长因子（EGF）等信号的激活而释放蛋白酶以降解基底膜。继而，内皮细胞会快速增殖迁移，形成新芽，将以每天几毫米的速度构建出新的血管网络。

目前，血管生成的检测方法主要包括体内和体外两种方式。体外方法通常用于监测血管生成过程中的特定阶段，在早期评估中具有重要的应用价值，而体内方法则能够更准确地模拟生命体微环境，提供更多相关信息。常用的体外实验包括增殖能力检测、迁移能力检测和管形成实验，体内实验则涵盖了雏鸡绒毛尿囊膜（CAM）测定、角膜血管生成实验和基质胶内血管生成实验等。为了获得全面且准确的数据，往往需要结合多种检测方法。本篇文章将专注于血管生成检测方法中应用最广泛的成管实验。

管形成实验

管形成实验（Tube Formation Assay）是一种快速定量方法，旨在模拟血管生成过程，以确定参与血管生成的基因或途径。该实验利用了体外培养的内皮细胞保留响应血管生成信号的能力，能够快速分裂和迁移。该实验最早于20世纪80年代建立，早期实验数据显示，在没有基底膜提取物的情况下，内皮细胞需要长达4-6周的时间才能形成管状网络。之后，Kubota将内皮细胞接种到重组基底膜的基质中，结果显示内皮细胞能够迅速形成类似于体内环境的毛细血管样结构，这一发现为管形成实验提供了一种高效的表型检测方式。

目前的实验常见方式是将内皮细胞在含有细胞外基质成分（如层粘连蛋白、巢蛋白、胶原蛋白等）和生长因子（如VEGF、EGF等）的基质胶上培养。在预定时间点拍摄图片，通过软件分析得到定量数据，从而观察三维毛细血管样结构的形成能力。这种方法简单、可靠且功能强大，广泛应用于研究血管生成的抑制剂和激活剂，探索血管生成机制，或定义内皮细胞群等。

实验步骤

以人脐静脉内皮细胞（HUVEC）为例，以下是常见的管形成实验流程：

1. 实验准备

（1）准备实验材料：在4°C条件下低温融化基质胶，并预冷所需器材（如枪头、细胞培养板等）。铺设基质胶时，需在冰盒上进行以避免其在温暖环境中凝固。
（2）基质胶的稀释与铺板：使用DMEM或条件培养基将基质胶稀释至8-12mg/mL，需根据实际情况调整。因每批基质胶浓度可能有所不同，建议在使用前进行不同梯度的稀释。将50μL稀释后的基质胶加入孔板，避免产生气泡，并在37℃培养箱中放置30-45分钟。
（3）细胞预处理：对于状态良好的细胞，使用标准的传代程序预处理。对HUVEC细胞进行饥饿处理，将完全培养基更换为含1% FBS的DMEM培养基，培养24小时。

2. 细胞铺板

（1）用杜氏磷酸缓冲液（DPBS）清洗细胞，加入胰蛋白酶消化HUVEC，离心沉淀后，用含10% FBS的DMEM或条件培养基重悬细胞，进行多次细胞计数以确保准确性。
（2）每孔加入100μL细胞悬液，接种密度为1至3×10⁴个细胞/孔，注意保持枪头垂直，避免接触孔内的凝胶。

3. 细胞培养观察

（1）在37℃、5% CO₂条件下培养细胞。
（2）可根据时间梯度进行观察，使用光学显微镜检查细胞。一般情况下，细胞在2-4小时内开始形成管状结构。HUVEC细胞在基质胶中约4小时后初步成管，管形成峰值一般在2-12小时之间，随后会出现结构塌缩现象。
（3）拍摄毛细管网络的图像，并使用相关软件分析管状网络的各类数据。

实例结果解读

HUVECs在实验过程中的行为变化表明，细胞在1小时左右附着于基质膜，随后在2-4小时内相互迁移形成毛细管样管，6-16小时后形成成熟的管状结构。24小时后，细胞逐渐凋亡，小管结构破裂并与基质分离。

常见问题

1. **阳性诱导剂对照组中无管网络形成如何处理？** 可能原因包括细胞老化、损伤、细胞状态不佳及基质胶浓度不适等。应采用健康且代数较低的细胞，并调整细胞接种密度。此外，确保使用的新鲜、质量良好的基质胶。
2. **怎样操作可使基质胶铺板均匀？** 确保基质胶低温保存并在冰上操作，垂直加入胶液，并确保固化时平面水平。
3. **成管实验需要多长时间？** 实验时长与细胞状态以及培养基血管生成因子的浓度有关，通常状态良好的细胞在2-3小时内开始成管。
4. **内皮细胞聚团如何处理？** 应检查细胞状态、调整接种密度及确保基质胶质量良好。
5. **应包含哪些对照组？** 初次实验需设置空白对照、阳性对照和阴性对照，并观察不同浓度的药物效果。
6. **应选择手动还是自动监测？** 选择性能取决于实验需求，若需处理大量样本，建议使用自动监测。

在血管生成研究中，尊龙凯时致力于提供创新的实验解决方案，帮助科研人员探索血管生成机制及治疗靶点，为生物医学研究贡献力量。